利用嗅覺感受器技術(shù)的氣味能有效控制身體異味。

各種令人不快的氣味，如身體異味，正在成為一個社會問題，部分原因是全球變暖和生活方式的多樣化。根據(jù)Statista匯編的數(shù)據(jù)，到2021年，除臭劑市場的全球收入預(yù)計將達到49.302億美元，到2025年的復(fù)合年增長率將達到5.2%。預(yù)計2021年最大的五個市場將是美國(49.3億美元)、巴西(24.86億美元)、德國(10.17億美元)、英國(8.92億美元)和法國(7.31億美元)；

(www.Statista.com/outlook/70070100/109/deodorants/united-states#market-arpu)。

相應(yīng)地，市場對各種高效除臭劑產(chǎn)品的需求也在迅速增加。對于它們的開發(fā)，通常使用化學(xué)除臭劑和/或具有遮蔽效果的香水來減少惡臭的技術(shù)。在惡臭掩蔽技術(shù)領(lǐng)域，嗅覺受體(OR)檢測技術(shù)作為高通量篩選高效掩蔽劑的最新技術(shù)，受到了極大的關(guān)注。

在這項研究中，我們在這項技術(shù)的基礎(chǔ)上，專注于抑制衰老和腋臭這兩種身體惡臭。OR2C1對衰老和腋下關(guān)鍵氣味成分(E)-2-壬烯醛、(E)-2-辛烯醛、1-辛烯-3-酮和1，5-辛二烯-3-酮均有反應(yīng)，并發(fā)現(xiàn)了OR2C1的潛在拮抗劑。

拮抗香味物質(zhì)在感官評定中明顯抑制了惡臭物質(zhì)的氣味強度。此外，在使用含有拮抗劑的香水的實驗中，這種效果得到了明顯的驗證。

綜上所述，利用嗅覺感受器技術(shù)成功地開發(fā)出了控制身體異味的香水。這種方法被認為是開發(fā)高性能遮蔽香料組合物的有效和快速的方法。

人體異味的分析與鑒定

為了改善生活環(huán)境，人們迫切需要對日常生活中的難聞氣味進行更有效的除臭。其中，人們對體味的意識最近有所提高。

體味大致分為“身體各個部位的氣味”，如口臭、腳臭、腋臭和頭皮氣味，以及“從軀干發(fā)出的混合氣味”。眾所周知，后者會隨著年齡的增長而變化，而且中老年人很容易不喜歡與年齡有關(guān)的氣味。這種氣味被稱為老化氣味(Kareishu)。據(jù)報道，2-壬烯醛和2-辛烯醛等不飽和醛是這種氣味的關(guān)鍵物質(zhì)。[1] 此外，青春期后腋窩產(chǎn)生的特殊氣味是最強烈的身體異味之一，使許多人感到惱火。據(jù)報道，1-辛烯-3-酮和1，5-辛二烯-3-酮等乙烯基酮類化合物具有極低的氣味閾值和強烈的金屬氣味，是腋臭的關(guān)鍵成分。它們對腋臭有很大的影響。[2] 圖1顯示了每種臭味的關(guān)鍵成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

圖1 每種惡臭主要成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)

現(xiàn)代去臭方案

針對各種惡臭，已經(jīng)開發(fā)了許多除臭方法。除臭方法一般分為生物法、化學(xué)法、物理法和感覺法。感官方法包括“遮蓋”，這是各種產(chǎn)品中最常用的，氣味被比惡臭更強烈的香味成分所掩蓋。然而，過度的“遮蓋”往往會因為氣味過濃而讓消費者感到不舒服。

我們聞到的氣味是分子量約為30-300的揮發(fā)性有機化合物(氣味分子)的聚合體。嗅覺感受器起到傳感器的作用，檢測每個氣味分子。

據(jù)報道，在人類中有396種嗅覺受體，在老鼠中有1130種。[3] 關(guān)于氣味分子被嗅覺感受器接受和識別氣味的機制已經(jīng)進行了大量的研究。最新技術(shù)使高效掩蔽劑的高通量篩選成為可能。近年來，市場上出現(xiàn)了一些基于調(diào)節(jié)嗅覺感受器活性技術(shù)的除臭劑產(chǎn)品。

在目前的工作中，我們致力于利用嗅覺感受器技術(shù)開發(fā)氣味控制香料。老化氣味和腋臭是體臭的全球重要代表，被選為目標(biāo)氣味。使用OR分析技術(shù)，我們搜索對惡臭的主要成分有反應(yīng)的OR，并搜索抑制OR活性的香料。我們應(yīng)用這些材料，成功地研制出了新型高效除臭香料。

克隆人嗅覺受體細胞的材料與方法

通過PCR從人類基因組DNA中克隆出398個人OR基因：女性(Promega Corporation，Madison)。將牛視紫紅質(zhì)N端20個氨基酸殘基插入pME18S載體，并將獲得的OR基因插入其下游，得到人OR基因表達載體。

熒光素酶報告基因檢測

HEK293T細胞在37°C、5%CO2氣氛中培養(yǎng)。對已報道的熒光素酶報告基因檢測方法進行了改進。[4] 采用雙葡萄熒光素酶檢測系統(tǒng)(Promega)測定螢火蟲和海腎蟲的熒光素酶活性。用含有cAMP反應(yīng)元件啟動子的螢火蟲熒光素酶載體pGL4.29[luc2P/Cre/hygro](Promega)檢測受體活性。用含有胸苷激酶啟動子的海腎蟲熒光素酶載體pGL4.74[hRluc/TK](Promega)作為細胞活力和轉(zhuǎn)染效率的內(nèi)對照。

將受體運輸?shù)鞍?短(RTP1S)基因?qū)雙ME18S載體，增強ORS的功能表達。將50 ng的人嗅覺受體(OR)基因表達載體、10 ng的RTP1S載體、10 ng的pGL4.29和5 ng的pGL4.74用脂質(zhì)體3000(Life Technologies，Carlsad，California)轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，在96個多聚D-賴氨酸涂層的孔板(BioCoat，Corning Inc.，New York)中培養(yǎng)24小時。

去除培養(yǎng)液后，用含氣味的50μL CD293培養(yǎng)基(Life Technologies)刺激轉(zhuǎn)染細胞，并添加20μM的L-谷氨酰胺。

刺激3h后，用微板式發(fā)光儀Centro LB960(Berthold Technologies GmbH，維也納)測量其發(fā)光強度。在對惡臭成分有反應(yīng)的ORs的篩選和OR2C1反應(yīng)抑制劑的篩選中，細胞培養(yǎng)在348個涂有聚D-賴氨酸的孔板中(Viewplate，PerkinElmer，Waltham，Massachusetts)，實驗規(guī)?？s小到上述數(shù)量的三分之一。用TriStar2LB942(Berthold)微板式發(fā)光儀測量其發(fā)光強度。

計算每孔螢火蟲發(fā)光與雷尼拉發(fā)光的比值。嗅覺受體反應(yīng)強度用倍增(FI)值表示，F(xiàn)I值是用氣味刺激細胞的比值除以無氣味刺激的比值計算出來的。

在抑制惡臭成分對OR2C1反應(yīng)的實驗中，它們的抑制效率用惡臭成分和拮抗劑混合物的FI值除以沒有拮抗劑的FI值計算出的歸一化響應(yīng)值來表示。用GraphPad Prism 6進行數(shù)據(jù)分析。

感官評價方法

20個訓(xùn)練組按照六點法氣味強度測量法進行感官評價。氣味強度根據(jù)強度分為以下幾類：0，無氣味；1，很弱；2，弱；3，明顯；4，強；5，很強。當(dāng)只出現(xiàn)惡臭時，得分設(shè)為4。將兩個棉球放入塑料瓶中，其中一個有10μL的惡臭，另一個有1μL的受試物質(zhì)。測試員每聞一下瓶子，就對惡臭的強度進行評分(圖2)。

圖2 感官評價示意圖。(a)嗅聞所用的塑料瓶；(b)如何嗅聞氣味。

異味成分

老化臭味：(E)-2-壬烯醛(東京化學(xué)工業(yè)株式會社)溶于0.1wt%檸檬酸三乙酯(東京化學(xué)工業(yè)株式會社)

腋臭：1-辛烯-3-酮(東京化學(xué)工業(yè))溶于0.1wt%檸檬酸三乙酯(東京化學(xué)工業(yè)株式會社)

異味模型

根據(jù)表2制備了含有(E)-2-壬烯醛和(E)-2-辛烯醛的老化惡臭模型(東京化學(xué)工業(yè))和含有1-辛烯-3-酮和1，5-辛二烯-3-酮的腋臭模型(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Dallas)。表1中列出的酸是由東京化學(xué)工業(yè)生產(chǎn)的。通過添加關(guān)鍵成分，兩種模型的臭味都達到了與實際老化臭味和腋臭高度相關(guān)的程度。

表1 (a) 老化味模型

(b) 腋臭味模型

香味模型

一種花香香水是由高砂鑒臣國際公司制作的模型香水(日本東京)。這款香水的組成原料是為了不抑制OR2C1的反應(yīng)而選擇的。在此模型香料中分別添加0.1-1.0%的拮抗劑。

人體ORs老化及腋臭關(guān)鍵成分篩查結(jié)果分析

我們篩選出對(E)-2-壬烯醛有反應(yīng)的人ORs。將瞬時表達人ORS的HEK293T細胞暴露于60μM的(E)-2-壬烯醛，用熒光素酶報告基因檢測其反應(yīng)。OR2C1對(E)-2-壬烯醛反應(yīng)強烈，OR1D2、2J2、4E2、5P3和52N2反應(yīng)弱(圖3)。

圖3 (E)-2-壬烯醛的人ORs的篩選(注：用熒光素酶報告基因檢測瞬時表達人ORs的HEK293T細胞對60μM(E)-2-壬烯醛的反應(yīng)。紅色條表示對倍增值為2或更大的(E)-2-壬烯醇刺激有反應(yīng)的OR。X軸上帶彩色條的數(shù)字(1-14、51、52和56)表示OR族，T表示TAARs)

我們證實了OR2C1對(E)-2-壬烯醛的量效關(guān)系。用不同濃度的(E)-2-壬烯醛刺激表達OR2C1的細胞或模擬細胞，用熒光素酶比色法測定它們的反應(yīng)。大于10μM的(E)-2-壬烯醛(圖4A)呈劑量依賴性地激活OR2C1，而模擬細胞對任何濃度的(E)-2-壬烯醛(圖4A)均無反應(yīng)。此外，我們還嘗試將表達OR2C1的細胞應(yīng)用于其他惡臭成分。結(jié)果，細胞不僅對(E)-2-辛烯醛(稱為老化惡臭關(guān)鍵成分)，而且對1-辛烯-3-酮和1，5-辛二烯-3-酮(稱為腋臭關(guān)鍵成分)也表現(xiàn)出劑量依賴性的反應(yīng)(圖4B-D)?？偠灾?，OR2C1對所有四種惡臭成分都有反應(yīng)。

圖4 OR2C1和模擬細胞對老化味和腋臭關(guān)鍵成分的反應(yīng)（注：瞬時表達OR2C1的HEK293T細胞對每個濃度的惡臭成分的反應(yīng)是用熒光素酶報告基因檢測的。惡臭成分為(A)(E)-2-壬烯醛；(B)(E)-2-辛烯醛；(C)1-辛烯-3-酮；(D)1，5-辛二烯-3-酮。橙色條表示OR2C1的倍增值，灰色條表示模擬的平均值。每條代表平均值±SE(n=3)）

尋找OR2C1的潛在拮抗劑

為了開發(fā)具有遮蔽作用的香料，我們篩選了800種使用(E)-2-壬烯醛的香料。我們用60μM(E)-2-壬烯醛和香料的混合物刺激表達OR2C1的細胞，并用熒光素酶測定法測定它們的反應(yīng)。結(jié)果，數(shù)十種材料抑制了細胞對(E)-2-壬烯醛的反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。

在這些潛在的拮抗劑中，我們選擇了6種物質(zhì)：1，4-二氧雜環(huán)庚烷-5，17-二酮(麝香T（高砂鑒臣國際公司的商標(biāo)名），化合物1)，2-甲基-4-[(1R)-2,2,3-三甲基環(huán)丙-3-烯1-基]丁-2-烯-1-醇(辛地諾（高砂鑒臣國際公司的商標(biāo)名），化合物2)、2,2,6-三甲基-α-丙基環(huán)己烷丙醇(Dextramber(高砂鑒臣國際公司的商標(biāo)名)，化合物3)、桉樹精油(EO)、廣藿香精油(EO)和香根草精油(EO)(表2)?；衔?-3由高砂鑒臣國際香料公司制造，精油由大阪早矢仕精細化工有限公司制造。它們的抑制活性被詳細確認如下。

表2 拮抗候選化合物的特征

首先，我們評價了化合物1的劑量-抑制關(guān)系。我們測定了不同濃度化合物1對60μM(E)-2-壬烯醛的反應(yīng)。化合物1在30μM和100μM(圖5 A)時顯著降低了OR2C1對(E)-2-壬烯醛的反應(yīng)。我們證實了使用(E)-2-壬烯醛發(fā)現(xiàn)的OR2C1拮抗劑是否也能抑制同樣的受體對其他惡臭成分的反應(yīng)。除了將配體改變?yōu)?E)-2-辛烯-3-酮、1-辛烯-3-酮和1，5-辛二烯-3-酮外，我們以與上述相同的方式進行了考察。化合物1對上述三種惡臭成分的OR2C1反應(yīng)均有抑制作用，且呈劑量依賴性(圖5 B-D)。

我們進一步從拮抗劑中選擇了化合物2和3、桉樹EO、廣藿香EO和香根草EO，并評價了它們對OR2C1反應(yīng)的抑制作用和對腋臭成分的抑制作用。我們用60μM(E)-2-壬烯醛或30μM-1-octen-3-one的混合物和5種不同濃度的物質(zhì)分別刺激OR2C1表達的細胞，并用熒光素酶測定法測定它們的反應(yīng)。所有五種材料都顯著抑制了OR2C1對衰老(圖6 A-E)和腋窩成分(圖7 A-E)的反應(yīng)。

圖5 化合物1抑制OR2C1對老化味和腋臭關(guān)鍵成分的嗅覺反應(yīng)（注：用熒光素酶報告基因分析法檢測瞬時表達OR2C1的HEK293T細胞對各濃度化合物1惡臭關(guān)鍵成分的反應(yīng)。惡臭成分為：(A)60μM(E)-2-壬烯醛；(B)60μM(E)-2-辛烯醛；(C)30μM-1-辛烯-3-酮；(D)60μM-1，5-辛二烯-3-酮。條形表示OR2C1的標(biāo)準(zhǔn)化反應(yīng)值，表示為平均值±SE(n=3)。采用單因素方差分析和Dunnett‘s檢驗，確定控制值(僅有惡臭成分)和測試值之間差異的顯著性。*p<0.001；**p<0.01；*p<0.05；ns，不顯著。）

圖6 拮抗劑對OR2C1對(E)-2-壬烯醛反應(yīng)的抑制作用（注：用熒光素酶報告基因分析法檢測瞬時表達OR2C1的HEK293T細胞對60μM(E)-2-壬烯醛對各濃度拮抗劑的反應(yīng)。拮抗劑為(A)化合物2，(B)化合物3，(C)桉樹EO，(D)廣藿香EO，(E)香根草EO。條形表示OR2C1的標(biāo)準(zhǔn)化反應(yīng)值，表示為平均值±SE(n=3)。采用單因素方差分析和Dunnett‘s檢驗，確定對照((E)-2-壬烯醛)與試驗值之間差異的意義。*p<0.001；**p<0.01；*p<0.05；ns，不顯著）

圖7 拮抗劑對OR2C1對1-辛烯-3-酮反應(yīng)的抑制作用（注：用熒光素酶報告基因分析法檢測瞬時表達OR2C1的HEK293T細胞對30μM1-octen-3-one與各濃度拮抗劑的反應(yīng)。拮抗劑為(A)化合物2，(B)化合物3，(C)桉樹EO，(D)廣藿香EO，(E)香根草EO。條形表示OR2C1的標(biāo)準(zhǔn)化反應(yīng)值，表示為平均值±SE(n=3)。采用單因素方差分析和Dunnett‘s檢驗，確定對照(單獨使用1-octen-3-one)和測試值之間差異的顯著性。*p<0.001；**p<0.01；*p<0.05；ns，不顯著）

感官評價

進行感官評估，以驗證該拮抗劑是否在人類嗅覺中起到體味抑制劑的作用。首先，檢測了一種香料對每種惡臭的感官抑制效果?；衔?、2、3和桉樹EO對(E)-2-壬烯醛和1-辛烯-3-酮的氣味強度有抑制作用。另一方面，水楊酸芐酯沒有抑制OR2C1反應(yīng)，也沒有降低每種氣味的強度(圖8 A，B)。

接下來，進行了更多的實際測試，以驗證將其應(yīng)用于生產(chǎn)級應(yīng)用的有效性。我們分別制備了含有拮抗劑的香水、老化惡臭模型和腋臭模型，它們主要由它們的關(guān)鍵成分組成。感官評價結(jié)果表明，該香精對模型惡臭(圖8 C、D)具有良好的防臭效果。不加拮抗劑的模型香水略微降低了惡臭的強度，并以此作為對照。這些結(jié)果從實際應(yīng)用的角度清楚地說明了這一點。

圖8 拮抗劑對各種惡臭抑制作用的感官評價（注：感官評定由20個訓(xùn)練有素的評審團按照六分制氣味強度測量法進行：0(無氣味)至5(非常強烈)。氣味與受試物的組合為：(A)(E)-2-壬醛香料；(B)1-辛烯-3-酮香料；(C)有/無拮抗劑的陳化氣味模型香料；(D)有/無拮抗劑的腋臭模型香料；(B)1-辛烯-3-1-酮香料；(C)有/無拮抗劑的老化氣味模型香料；(D)有/無拮抗劑的腋臭模型香料。每條代表平均值±SE(n=20)）

討論

為了開發(fā)有效去除難聞氣味的新香料，我們使用OR分析技術(shù)來尋找對惡臭關(guān)鍵成分有反應(yīng)的ORs和降低OR活性的香料。

選擇(E)-2-壬烯醛和(E)-2-辛烯醛作為陳化惡臭成分，1-辛烯-3-酮和1，5-辛二烯-3-酮作為腋臭成分。

我們發(fā)現(xiàn)一些ORs對(E)-2-壬烯醛F-4有反應(yīng)，其中OR2C1對所有四種惡臭成分都有劑量依賴性的反應(yīng)(圖4 A-D)。考慮到OR2C1對辛硫醇和壬硫醇也有反應(yīng)，OR2C1可能識別鏈長約為8-9的線性分子[5]，這些OR2C1配體彼此之間沒有相似的氣味。在人類嗅覺系統(tǒng)中，與高度依賴OR5AN1的麝香氣味知覺不同，OR2C1可能并不單獨對氣味質(zhì)量起到識別作用[6,7]。

我們篩選了抑制OR2C1對(E)-2-壬烯醛反應(yīng)的芳香物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)了數(shù)十個候選拮抗劑。其中，化合物1抑制OR2C1對所有四種惡臭成分(圖5 A-D)的活性。此外，化合物2、3和三種精油中的每一種都降低了OR2C1對(E)-2-壬烯醛和1-辛烯-3-酮(圖6 A-E和圖7 A-E)的反應(yīng)。這表明一個拮抗劑可以掩蓋多種類型的惡臭。

在感官評價中，拮抗劑還降低了老化氣味和腋臭成分的氣味強度(圖8 A，B)。感官評價結(jié)果表明，拮抗劑確實抑制了惡臭，支持了該方法的有效性。此外，含有這些拮抗劑的香精對模型衰老和腋臭(圖8 C，D)有很好的控味效果。

有趣的是，一種拮抗劑可以抑制老化氣味和腋臭的惡臭。另一方面，OR2C1抑制活性的有效性與感覺評價中的掩蔽性能之間沒有明顯的相關(guān)性。造成這種差異的原因之一是感官評價中的揮發(fā)性等物理特性的影響。此外，與OR2C1以外的OR的交互也不能被忽略。雖然OR分析不是一種完美無缺的方法，但它對于掩蔽劑候選的選擇仍然是非常有效的，而且這種方法可以顯著減少開發(fā)工作量。

結(jié)論

OR2C1被發(fā)現(xiàn)是老化味和腋臭關(guān)鍵氣味成分共同的受體。

利用香料發(fā)現(xiàn)了OR2C1的潛在拮抗劑。感官評價結(jié)果表明，拮抗香料對惡臭物質(zhì)的惡臭強度有明顯的抑制作用。此外，在使用含有拮抗劑的香水的實驗中，這種效果也得到了明顯的驗證。這些結(jié)果表明，從實際應(yīng)用的角度來看，該方法具有重要的意義。綜上所述，利用嗅覺感受器技術(shù)，成功開發(fā)了控制人體異味的香水。這種方法被認為是開發(fā)高性能遮蔽香料組合物的有效和快速的方法。

最后，我們可能要注意到，單靠拮抗劑來控制惡臭并不容易。這是因為惡臭通常不只由一個關(guān)鍵成分組成。最好的解決方案是將該方法與其他控制惡臭技術(shù)結(jié)合使用，這些技術(shù)通過與整個惡臭相協(xié)調(diào)來有效地減少不適感。

將此方法應(yīng)用于我們最終的香精創(chuàng)作中，有望在除臭方面帶來新的突破。

宮原久志在日本神奈川高砂鑒臣國際香料的企業(yè)研發(fā)部門任職，電子郵件：Hisashi_Mihara@takasago.com

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